大鼠TNFα试剂盒；肿瘤坏死因子αELISA试剂盒检测原理

本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析大鼠血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中TNFα的含量。预先包被的抗体为TNFα多克隆抗体。检测相抗体为TNFα多克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNFα呈正相关。

TNFα前体是以跨膜蛋白的形式存在于细胞内，在细胞外被剪切成 17KDa的成熟形态（157个氨基酸）。活性的TNFα以非共价键二聚体、三聚体甚至五聚体的形式存在，但在SDS-PAGE显示为单一17KDa条带。很多细胞都能合成TNFα，包括各种免疫细胞（单核细胞、巨噬细胞、T、B细胞、粒细胞、NK细胞）和非免疫细胞（上皮细胞、纤维细胞、肌细胞、Kuppfer细胞等）。TNFα的合成受到很多因素的影响。其生理功能最早认为是有抗肿瘤活性，现在已明确不仅能调节肿瘤细胞的生长，对很多细胞的生长、分化和代谢都有影响。TNFα是免疫宿主反应的快速反应因子。其另一特点是在免疫疾病中有病理性作用。本试剂盒所用标准品为重组大鼠TNFα，总157个氨基酸，分子量为17KDa。

检测指标：TGF-β1；TGFβ1
检测范围：15.6pg/ml～1000pg/ml
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜2pg/ml

产品组成：

储存条件：2-8℃（频繁使用时），-20℃（长时间不用时）
有效期： 6个月(4℃)；12个月（-20℃）

参考标准曲线数据：(取自某一批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线)

大鼠TNFα试剂盒；肿瘤坏死因子αELISA试剂盒用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 　　

1. 在包被溶液中稀释纯化的包被抗体（一般0.5-4μg/ml），将该稀释后的包被抗体100μl/孔加入到酶标板内。

2. 用封板膜将板封好防止蒸发，在室温（或4℃）孵育过夜。

3. 吸干每一板孔并加洗液洗涤，重复3次。使用洗瓶、多道移液器、多功能分装器或洗板几，每孔加400μl彻底洗涤。规范的操作要求每步完全移出孔中的液体。*一步，将板中液体移出并将板子在干净的纸巾上吸附。

4. 加200-300μl/孔封闭液封板，室温至少孵育1小时。

5. 重复步骤3，可利用真空泵干燥板子。加入干燥剂并封板，至少在4-8℃可贮存2个月。

6. 每孔加100μl适当稀释的标准品和标本，轻轻敲打板子1分钟。贴上封板膜，室温孵育2小时。

7. 重复步骤3

8.每孔加100μl经过适当稀释的生物素化的检测抗体，贴上新的封板膜，室温孵育2小时.

9. 重复步骤3

10. 每孔加100μl经过适当稀释的Avidin-HRP或 Streptavidin-HRP，也可加其它种类预先优化物11. 重复步骤3

12. 每孔加100μl底物溶液，避光，室温孵育5-30分钟进行显色反应

13. 每孔加50μl终止液，轻轻振荡板子确保充分混匀

14. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二　用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，

37℃孵育30-60分钟，洗涤,*一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

大鼠TNFα试剂盒；肿瘤坏死因子αELISA试剂盒重复性

板内，板间变异系数均<10%。

典型数据

由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

精密度

板内精密度:低浓度样本,中浓度样本和高浓度样本分别在1块板子上检测20次。

板间精密度:低浓度样本,中浓度样本和高浓度样本分别在3块板子上检测20次。

回收率

分别往5个不同样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围和平均回收率。

大鼠TNFα试剂盒；肿瘤坏死因子αELISA试剂盒线性

分别往5个样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。将5个样本分别稀释2倍，4倍，8倍，16倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。

试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在4℃保存一周；如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。

说明：所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。

试剂体积以实际发货版说明书为准。相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。

试验所需自备物品

1. 酶标仪(450nm波长滤光片)

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL

3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4. 吸水纸

ELISA标本的制备和贮存

检测可溶性蛋白：根据产品说明书制备血清、血浆标本，由于有些样品对温度敏感极易丧失活性，应尽快分离并分装（一般300～500ul/管），大多数标本收集和实验在同一天应贮存在2～8℃。若无法立即测定，应贮存在-70℃，标本贮存时间一般不宜过长，避免反复冻融。使用前将标本平衡至室温，融化标本严禁使用水浴锅。冻存后或冷藏时间过长的标本可能会出现沉淀或小凝集块，应在实验前离心或过滤（0.45um滤膜）标本，体积少的标本不建议过滤。所有标本的收集要使用无菌管，在无菌/半无菌条件下操作防止污染。