分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，释放的CoA还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率可计算AAT活性。

组成：

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅、无水乙醇。

粗酶液提取：

1.     组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.     细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.     液体：直接检测。

FA005-25T/24S-AAT测定操作：

1、分光光度计预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入22.5mL试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇1.25mL充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。

4、空白管：在Ep管或96孔板中加入50μl提取液和900μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μL试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A空白管。

5、测定管：在Ep管或96孔板中加入50μl样本和900μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μL试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A测定管。△A=A测定管- A空白管，空白管只要做一管。

FA005-50T/48S-AAT测定操作：

1、分光光度计预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入45ml试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇2.5ml充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。

4、空白管：在Ep管或96孔板中加入50μl提取液和900μl工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μl试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A空白管。

5、测定管：在Ep管或96孔板中加入50μl样本和900μl工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μl试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A测定管。△A=A测定管- A空白管，空白管只要做一管。

AAT活性计算公式：

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /mg prot) = △A ÷（×d）×V反总÷（V样×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷（×d）×V反总÷(W×V样÷V样总) ÷T =98.04×△A÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /104cell) = △A ÷（×d）×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=98.04×△A÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /ml) = △A ÷（×d）×V反总÷V样÷T =98.04×△A

：TNB消光系数，13600L/mol/cm；V反总：反应总体积，1ml；V样：加入反应体系中上清液体积，0.05ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，15 min。