Adeno-associated Virus(AAV)腺伴随病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点

腺伴随病毒(Adeno-associated Virus，AAV) 属细小病毒科，病毒颗粒直 径为 20nm，无包膜，20 面体，为目前动物病毒中 的一类单链线状 DNA 病毒。在普通人群中，AAV 感染率很高，85%的人呈血清抗体阳性，但是未发现 AAV 引起人体疾病，甚至早年的流行病学研究报告认为，AAV 感染者减少了患 癌的危险性，对人体医学 研究具有重要意义，因此快速检测腺伴随病毒具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染 性疾病的主流技术，本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测腺伴随病毒属细菌的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据腺伴随病毒DNA的高度保守区设计，in silico分析发现其不会跟其他非腺伴随病毒的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6.既可用于定性，又可用于定量，用于定量时线性范围至少有5个数量级。
本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。

一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传 染性 病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染 性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液， 用带芯枪头，下同）。

1. 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

2. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

3. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

5. 如果有N个样品， 设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL 第4号稀释液（第6步所得）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样本制备PC。另外用水作为样本制备NC。

6. 用自选方法纯化样品的DNA，本扩增试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（可直接用第6步所得的第4号稀释液）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后 加）：

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

四、数据处理

1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。