Human Adenovirus B14（HAdV-B14）人腺病毒B14型探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点

规格及成分

使用方法

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
如果做定性实验，则此步可以跳过。如果做定量实验，则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（ 用带芯枪头，下同）。
3. 在 6 号管中加入 5μL1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5 号管中加入 5μL1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 4 号管中加入 5μL1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照（上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是样品制备 PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管中的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为描述操作步骤，
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后 加）:

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR:

四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 45。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 40。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 45 则为阴性，如果小于或等于 40 则为阳性。如果在 40-45 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 45，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。