Rift Valley Fever Virus(RVFV)裂谷热病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品及特点
规格及成分
使用方法
一、稀释标准曲线样品(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传 染 性 病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传 染 性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光RT-PCR专用模板稀释液, 用带芯枪头,下同。
3.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
7.如果有N个样品, 设置N+2个提取,多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的10000倍稀释液10μL再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNAout或免提取核酸释放剂。
三、Probe qRT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个RT-PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复,则标记N+4个RT-PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板),1个用于RT-PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后 加):
成分/每管 |
样品管 N+2个 |
RT-PCR阴性对照 |
标准曲线样品管 (2-7管) |
探针法qRT-PCR缓冲液 |
10 μL |
10 μL |
10 μL |
探针法qRT-PCR酶混合液 |
2 μL |
2 μL |
2 μL |
裂谷热病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液 |
3 μL |
3 μL |
3 μL |
N+2个待测RNA样本 |
5 μL |
不加 |
不加 |
自备超纯水 |
不加 |
5 μL |
不加 |
第6步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) |
不加 |
不加 |
5μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行RT-PCR:
过程 |
温度 |
时间 |
逆转录 |
50℃ |
20 min |
预变性 |
94℃ |
5 min |
RT-PCR反应 (45个循环) |
94℃ |
20 sec |
|
62℃ |
20 sec(采集FAM通道的荧光信号) |
|
72℃ |
40 sec |
五、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于38。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于38则为阳性。如果在38-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。