α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒/微量法说明书

测定意义：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。

测定原理：

α-KGDH 催化 α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、 二氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示 α-KGDH 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
 
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 α-KGDH 活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂五中加入 18mL 试剂四充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min；现配现用；
（2）在试剂六中加入 1mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂六和 180μL 试剂五，混匀，立即记录340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性计算： 
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.65×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=650×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.3×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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