外切β1，4葡聚糖酶/纤维二糖水解酶(C1)测试盒/微量法说明书

测定意义：

C1（EC3.2.1.91）存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份之一，C1催化多聚糖链的末端非还原端释放出纤维二糖和葡萄糖。

测定原理：

采用3,5－二硝基水杨酸法测定C1催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。
 
需自备的仪器和用品： 
酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制： 
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；
 
样品测定的准备： 
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
 
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

混匀， 90℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），冷却后，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，测540nm 下吸光值 A，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
C1 活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 6.4078x - 0.0673；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、血清（浆）C1 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反总]÷V 样÷T=14.305×(ΔA+0.0673)
3、细胞、细菌和组织中 C1 活力的计算
（1）按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.0286×(ΔA+0.0673)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.11mL； V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，120 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 3.2039x - 0.0673；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、血清（浆）C1 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反总]÷V 样÷T=28.61×(ΔA+0.0673)
3、细胞、细菌和组织中 C1 活力的计算
（1）按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
C1 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.057×(ΔA+0.0673)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.11mL； V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，120 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。