异柠檬酸裂解酶(ICL)测试盒/微量法说明书

测定意义：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理：

ICL 催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在 LDH 的作用下生成乙醇和 NAD，NADH 在340nm 下有特征吸收峰，监测 340nm 吸光度的减小速率可间接反应 ICL 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 360μL×1 支，4℃保存；
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃
（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；（2）在试剂四中加入 4mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、150μL 工作液和 40μL 试剂四，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
ICL 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。  

ICL（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1608×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.215×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ICL（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=3216×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=6.25×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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