pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体

描述：

pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产品适用于 Taq 酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。
组分

注意：RTS DH5α 冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2 年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3 个月）。
主要特征
（1）快速连接， 仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含任何酶切位点，便于后续亚克隆（5）平末端和 A 尾产物通用。
注意：引物不能磷酸化。
测序引物

操作步骤
1. PCR 产物的纯化
1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。
1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。
2. PCR 用量和连接时间

关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。
4. 转化(以 RTS DH5α 克隆感受态细胞为例说明)
4.1 从-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent 融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli Transfection Reagent 加入到一支冻干感受态细胞中，并分装到 10 支 1.5 ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。
4.2 将 5 μl 连接产物加入到分装的感受态细胞中，轻弹 EP 管（或枪头轻轻吹打），置于冰上 15 min。
注意：放置时间不要超过 30 min，过长时间会导致核酸聚合，从而影响转化效价。
4.3 置于 42°C 热激 1min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。
4.4 热激完毕后，向上述感受态细胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培养基，37°C 振荡（225 rpm）培养 60 min。
使质粒上抗性标记基因表达，菌体复苏。
4.5 取 200 μL 复苏菌液涂布到含相应抗生素的 LB 琼脂平板表面。
4.6 将平板置于 37°C 培养，12~18 小时后可出现菌落。

注意：如使用液体感受态，直接将 5 μl 连接后产物加入到液体感受态，并参照液体感受态操作方法即可。

5. PCR 菌检挑选阳性克隆菌落（连接产物条带单一、清晰情况下，阳性率>95%，可无需菌检，直接测序，本步骤可省略）
5.1 用 10 μl Tip 头挑取生长良好的单个菌斑，放置于 10 μl 无菌水中吹打几次混合均匀。
5.2 取 1 μl 上述菌液于 20 μl PCR 体系中，用 PCR 特异性引物或者 M13F(-47)和 M13R(-48)鉴定阳性克隆。
5.3 以上述菌液为模板进行 PCR 扩增，并电泳检测（如载体自连接，则菌检 PCR 扩增长度为：140bp）。

6. 质粒提取及测序
将鉴定为阳性的菌液接种于 5ml LB 培养基中（含 100ug/ml 氨苄青霉素），37°C 振荡（225 rpm）培养过夜，提取质粒。并使用 M13F(-47)或 M13R(-48)进行测序。

临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。