组织/细胞miRNA提取试剂盒

描述：

组织细胞 miRNA 提取试剂盒是目前 上提取小 RNA（<200nt）操作步骤 、重复性 、小 RNA 产率 的方法。使用该试剂盒提取的小 RNA（Small RNA）中，长度在 15～200nt 范围的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。使用该试剂通过一步上柱即可获得高纯度 miRNA，可在 45min 内完成小 RNA 的提取。该试剂盒广泛适用于动物组织、细胞和多糖多酚含量不高的植物组织样本。

组分：

操作方法：
1. 组织样本提取
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。植物组织则再加入 10μl β-巯基乙醇，混合均匀。
(2) 在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震荡至组织粉末 溶解于裂解液中。室温静置 5min 以充分裂解细胞。
注意：将组织加入到 miRNA Reagent A 后要迅速将组织震散，否则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务必用移液器将团状组织吹打松散。
(3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 350μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm 离心 5min，吸取 550μl上清液，转移到新的 1.5ml EP 管中。
(4) 向上述溶液中加入 200μl 无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5min。
(5) 13,000rpm 离心 10min，转移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。
(6) 向上述溶液中加入 300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。
(7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm离心 1min，倒掉过滤液。
(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心 1min，倒掉过滤液。
(9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心 1min，倒掉过滤液。
(10) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。
(11) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree TE
Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物即为提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 该产物，即可使用一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应）。

2. 细胞样本提取
(1) 贴壁细胞：胰酶消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用 100μl1×PBS 重悬细胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 颠倒混合均匀，室温放置 5min。
(2) 悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用 100μl 1×PBS重悬细胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 颠倒混合均匀，室温放置 5min。
(3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 250μl miRNA Reagent
B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm 离心 5min，吸取 550μl上清液，转移到新的 1.5ml EP 管中。
注意：加入细胞体积数与 miRNA Reagent B 总体积数为350μl。如加入 50μl细胞，则 miRNA Reagent B使用 300μl。
(4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5min。
(5) 13,000rpm 离心 10min，转移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。
(6) 向上述溶液中加入 300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。
(7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm离心 1min，倒掉过滤液。
(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心 1min，倒掉过滤液。
(9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心 1min，倒掉过滤液。
(10) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。
(11) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物即为提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 该产物，即可使用一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应）。

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